RNA結(jié)合蛋白(RBP)可通過細胞內(nèi)的無膜細胞器(MLO)調(diào)控基因表達。Rim4是釀酒酵母細胞中的一種RBP，能夠形成減數(shù)分裂所需的淀粉樣蛋白聚集。當出現(xiàn)溫度升高等環(huán)境變化導致細胞應激時，Rim4濃縮形成可逆的應激顆粒(圖1C)。

圖1 A：Rim4蛋白結(jié)構(gòu)域和減數(shù)分裂示意圖；B：AlphaFold預測的Rim4的三維結(jié)構(gòu)；C：減數(shù)分裂前期I的細胞中GFP-Rim4在不同的條件應激下形成foci。

近期，發(fā)表于bioRxiv的一篇文章利用超精準可調(diào)節(jié)溫度控制模塊-VAHEAT對活細胞內(nèi)溫度誘導相變進行了深入研究^[1]。

研究人員將酵母細胞懸液滴加在VAHEAT的智能基板上并放置于顯微鏡適配器中，連接上VAHEAT控制器，即可實現(xiàn)對細胞樣品的溫度控制。VAHEAT可在0.1s左右使樣品到達實驗所需的溫度并穩(wěn)定控溫。當加熱至一定的溫度，且經(jīng)過一定時間后，Rim4即可濃縮形成foci，并主導細胞質(zhì)應激顆粒的生成(圖2D-圖2F)，顆粒中含有酵母應激顆粒的標記物Pab1 (圖2G&圖2H)，以及mRNA(圖2I)。

圖2 D：不同溫度下Rim4隨時間推移形成foci；E：圖1D中不同溫度下信號強度的標準差；F：圖1D中不同溫度下細胞內(nèi)的平均foci數(shù)量；G&H：加熱后與未加熱的Pab1和Rim4的共定位；I：加熱后與未加熱的FISH結(jié)果。

Rim4含有三個RNA識別基序(RRM)，由內(nèi)在無序區(qū)域(IDR)連接，而IDR能夠引導Rim4 foci的形成。IDR殘基Rim4 (IDR₃)在細胞沒有因溫度升高導致應激時也可以聚集形成foci，而C端IDR切除后的Rim4(△IDR₃)在溫度升高時的foci形成明顯下降，以上結(jié)果說明Rim4在沒有mRNA時也可以由IDR引導自組裝形成foci(圖3)。

圖3 上：GFP-Rim4，GFP-Rim4(?IDR₃)和GFPRim4(IDR₃)的示意圖；下：上述Rim4及變體在加熱前和加熱后的分布。

實驗發(fā)現(xiàn)，盡管Rim4在細胞核和細胞質(zhì)中均等分布，溫度升高時生成foci的主要是細胞質(zhì)中的Rim4。研究人員使用了具有RNA結(jié)合缺陷的Rim4(FLm)突變體，其僅有一個功能正常的RRM，相對于野生型的RNA結(jié)合下降，但不會自組裝。加熱后，細胞核中的Rim4(FLm)迅速形成了foci(圖4)，這說明RNA結(jié)合能夠抑制Rim4的自組裝。

圖4: 加熱后細胞核中Rim4(FLm)形成foci。

根據(jù)以上結(jié)果，研究人員使用了一個熱誘導產(chǎn)生減數(shù)分裂應激顆粒的模型(圖5)。

圖5 Rim4自組裝后結(jié)合RNA和RBP形成應激顆粒的過程

在細胞質(zhì)內(nèi)的Rim4 foci形成的開始階段(42?C, 10 sec)，與Pab1幾乎沒有共定位；Rim4 foci完整形成后(42?C, 5 min)，能夠與Pab1結(jié)合(圖6)。

圖6 加熱時，Rim4首先形成foci，然后與Pab1結(jié)合。

最后，研究人員檢測了溫度升高導致的Rim4自組裝和減數(shù)分裂應激顆粒的生成對減數(shù)分裂和孢子形成的影響。結(jié)果表明，減數(shù)分裂間期Ⅰ細胞的細胞自噬標記蛋白Atg8與Rim4 foci在溫度變化及回復期間均未發(fā)生共定位；不同時期的細胞裂解后，裂解液中的Rim4蛋白水平在加熱過程中和加熱后恢復時沒有改變（圖7），說明Rim4的濃縮能夠使其在細胞應激時也能夠保持穩(wěn)定，直到減數(shù)第一次分裂時再分解，進而啟動減數(shù)分裂中后期的翻譯過程。

圖7 左：未加熱，加熱中和加熱后，Atg8與Rim4均未發(fā)生共定位；右：不同時期細胞裂解液的Rim4水平未受細胞自噬影響。

綜上所述，減數(shù)分裂特異性的RNA結(jié)合蛋白Rim4，經(jīng)過熱刺激誘導形成可逆的應激顆粒，通過抑制翻譯來抑制減數(shù)分裂以防止減數(shù)分裂錯誤。最后，熱刺激誘導的Rim4 foci能夠進行自組裝，并且結(jié)合mRNA和其他RBP如Pab1。未來的研究方向應是闡明由Rim4驅(qū)動的減數(shù)分裂應激顆粒的組成和功能，以及Rim4如何轉(zhuǎn)換其蛋白質(zhì)狀態(tài)以執(zhí)行功能。

在以上研究中，VAHEAT能夠?qū)悠分苯?、快速地加熱至所需溫度并保持恒溫，且適配多種熒光顯微鏡以實現(xiàn)樣品的實時快速成像。該技術來源于德國著名的馬克斯-普朗克研究所 （MPI） ，兼容市面上絕大多數(shù)的商用顯微鏡和物鏡，可在高清成像的同時快速和精確地調(diào)節(jié)溫度，加熱速率可達100℃/s，最高溫度可達200℃，穩(wěn)定性0.01℃。該模塊自2021年問世以來，已在《Journal of the American Chemical Society》、《Small》、《EMBO Journal》、《Nature Communications》、《Nature Methods》、《Nature Nanotechnology》等高水平期刊發(fā)表數(shù)十篇文獻。

圖8 VAHEAT實物圖

圖9 A:  VAHEAT   各部件名稱B:  VAHEAT 配有容納液體樣品的智能基板，可安裝在顯微鏡上C:  VEAHEAT 智能基板含有氧化銦錫 （ITO） 加熱元件和溫度探頭

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參考文獻：

[1]. Zhang,   R., Li, S., Feng, W., Qian, S., Chellappa, A. J., & Wang, F. (2024). Rim4   is a Thermal Sensor and Driver of Meiosis-specific Stress Granules. bioRxiv.