傳統(tǒng)高壓透射電子顯微鏡 (TEM) 的樣品制備通常使用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛等重金屬元素染色劑。然而，由于醋酸雙氧鈾的高毒性、日益嚴(yán)格的法律法規(guī)以及復(fù)雜的廢物處理問(wèn)題，科研工作者開(kāi)始逐步減少使用這種染色劑并探究更加無(wú)害便捷的生物樣品透射成像工具。
為了研究不同成像和染色策略對(duì)生物樣品透射成像的影響，捷克科學(xué)院的Vladislav Krzyzanek團(tuán)隊(duì)與Delong公司合作，使用無(wú)需負(fù)染的LVEM25低電壓生物型透射電子顯微鏡及傳統(tǒng)200kV透射電子顯微鏡分別觀察未染色的及用檸檬酸鉛、醋酸雙氧鈾染色的藍(lán)藻切片樣品。所得結(jié)果以Urany-Less Low Voltage Transmission Electron Microscopy: A Powerful Tool for Ultrastructural Studying of Cyanobacterial Cells 發(fā)表在Microorganisms 上。
該研究團(tuán)隊(duì)制備了用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染的藍(lán)藻細(xì)胞切片以及無(wú)負(fù)染的藍(lán)藻細(xì)胞切片（切片厚度75nm），使用傳統(tǒng)的200kV透射電鏡與LVEM25生物型透射電子顯微鏡對(duì)這些樣品進(jìn)行了觀察。如下圖所示，圖A中傳統(tǒng)透射電鏡下的細(xì)胞切片幾乎無(wú)法觀察細(xì)胞的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，圖B和圖C可以清楚地觀察到藍(lán)藻的內(nèi)部囊泡結(jié)構(gòu)。
圖1. (A) 200 kV加速電壓，無(wú)染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(B) 200 kV加速電壓，用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(C) 25 kV加速電壓（LVEM25），無(wú)染色藍(lán)藻細(xì)胞切片，(D) 25 kV加速電壓（LVEM25）并用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色藍(lán)藻細(xì)胞切片。 標(biāo)尺：1 µm。
通過(guò)下圖可以觀察到，使用200kV電鏡觀察醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染的樣品（左圖）與25kV電鏡觀察非負(fù)染的樣品（右圖），均可清晰的觀察藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)的類囊體（箭頭所指）、羥基體（三角形標(biāo)記）、糖原顆粒（gg標(biāo)記）等細(xì)胞內(nèi)部的超微結(jié)構(gòu)。同時(shí)25kV觀察的非負(fù)染樣品表面由染色液造成的“噪聲"更低，超薄切片機(jī)刀片切割的痕跡都清晰可見(jiàn)，核糖體等顆粒的襯度（黑白對(duì)比度）更高。
圖2. 使用不同成像條件獲取藍(lán)藻細(xì)胞的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)。
(A) 使用醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色的樣品，使用 200 kV 電鏡成像；(B) 未染色的樣品，使用 25 kV（LVEM25）成像。箭頭標(biāo)記的細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)：類囊體膜； 箭頭：PHA顆粒； 三角形：羧基體； 十字：沖掉的顆粒； gg：糖原顆粒。 標(biāo)尺：500 nm。
此外，為了檢查減少色差的可能性（色差在使用較低能量的電子成像時(shí)通常會(huì)引起問(wèn)題），還使用掃描透射電子顯微鏡（STEM）在 15 kV 加速電壓下對(duì)樣品進(jìn)行了成像。 如下圖所示，使用重金屬負(fù)染液可能殘留沉淀的重金屬染液雜質(zhì)，這些質(zhì)密的雜質(zhì)會(huì)在成像過(guò)程中留下“偽影"，導(dǎo)致觀察者無(wú)法準(zhǔn)確判斷生物樣品的結(jié)構(gòu)特征。
圖3. LVEM25生物型透射電鏡的STEM模式在 15 kV 加速電壓電子束藍(lán)藻細(xì)胞進(jìn)行成像。
A：未染色的樣品，B:使用乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色的樣品。 雜質(zhì)用箭頭標(biāo)記。標(biāo)尺：1 µm
LVEM25兼具STEM成像模式，15kV的STEM 提供了藍(lán)藻細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的清晰圖像，具有令人滿意的對(duì)比度且15kV的STEM對(duì)負(fù)染樣品成像的對(duì)比度更佳（見(jiàn)下圖B/D）。
圖4.使用LVEM25在不同成像模式下獲得的藍(lán)藻細(xì)胞圖像的比較。
（A）使用 LVEM25在 TEM 模式下成像的未染色樣品，(B) 使用 LVEM25在 TEM 模式下成像的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛負(fù)染樣品，(C) 使用 LVEM25在 STEM 模式(15kV)下成像的未染色樣品，(D) 使用 LVEM25在 STEM 模式(15kV)下成像的乙酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色樣品。 標(biāo)尺：1 µ
綜上所述，傳統(tǒng)的200kV透射電鏡負(fù)染成像與LVEM25非負(fù)染成像都為我們提供了有關(guān)藍(lán)藻細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)的詳細(xì)圖片。而使用LVEM25成像的未染色樣品在檢測(cè)到的圖像中顯示出超小的“噪聲"。而且與傳統(tǒng)染色相比，細(xì)胞內(nèi)的糖原顆粒也更清晰可辨。傳統(tǒng)染色成像樣品圖像中的由染色液沉淀造成的“噪聲"與“偽影"更加明顯，會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)原本存在的質(zhì)密顆粒（如糖原）被誤認(rèn)為是染液的污染，LVEM25則擺脫了這些傳統(tǒng)重金屬負(fù)染液帶來(lái)的成像問(wèn)題。同時(shí)LVEM25兼具的STEM成像模式也可以對(duì)生物樣品取得良好的成像效果。
上述研究使用的LVEM25生物型透射電子顯微鏡，采用了25kV的低加速電壓設(shè)計(jì)，一次性地?cái)[脫了上述所有的成像難題，LVEM25還可以對(duì)病毒、細(xì)菌、脂質(zhì)體、外泌體等生物樣品無(wú)負(fù)染直接成像，為生物樣品的電鏡成像提供尤為便捷高效的解決方案。
圖5. LVEM25成像實(shí)例 A：腺相關(guān)病毒 B：擬菌病毒 C：脂質(zhì)體 D：成纖維細(xì)胞與細(xì)菌
傳統(tǒng)高壓透射電鏡本身就會(huì)帶來(lái)樣品細(xì)節(jié)損失，在80-120kV下的透射電鏡成像過(guò)程中，大量十幾納米尺寸的顆粒會(huì)直接被“擊穿"。而LVEM25生物型透射電鏡采用的25kV低電壓設(shè)計(jì)，不僅避免了傳統(tǒng)高壓透射電鏡長(zhǎng)時(shí)間照射對(duì)于生物樣品、有機(jī)納米顆粒的損害，還可以保留下更多地小有機(jī)顆粒圖像，獲得更多地細(xì)節(jié)。
圖6. 有機(jī)納米顆粒成像 左：80kV條件下成像 右：LVEM25成像
LVEM25生物型透射電子顯微鏡技術(shù)特點(diǎn)：
高襯度：低能量電子對(duì)有機(jī)分子產(chǎn)生更強(qiáng)烈的散射，具有更高對(duì)比度。
無(wú)需染色：突破以往生物/輕材料成像需要重金屬染色的局限性。
高分辨率：無(wú)染色條件下能夠達(dá)到1.0 nm的圖像分辨率。
多模式：LVEM25能夠在TEM、STEM模式中自由切換。
高效方便：真空準(zhǔn)備只需要3分鐘，空間小，環(huán)境需求低。
易操作且成本低：友好智能化操作界面，低耗材，低維護(hù)費(fèi)用，無(wú)需專業(yè)操作人員。
LVEM25生物型透射電子顯微鏡
參考文獻(xiàn)：
[1]. Mrazova K, Bacovsky J, Sedrlova Z, et al. Urany-Less Low Voltage Transmission Electron Microscopy: A Powerful Tool for Ultrastructural Studying of Cyanobacterial Cells[J]. Microorganisms, 2023, 11(4): 888.
相關(guān)產(chǎn)品：
1、低電壓臺(tái)式透射電子顯微鏡-LVEM5 
更新時(shí)間：2023-11-15
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