科研進(jìn)展

Moorfield薄膜生長設(shè)備的用戶英國劍橋大學(xué)Christopher J. Russo教授研究組用高質(zhì)量的薄膜生長與加工技術(shù)制備了用于冷凍電鏡樣品制備的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)，該金屬網(wǎng)使得冷凍電鏡觀察生物大分子樣品時樣品的位置漂移小于1埃米，進(jìn)步提高了冷凍電鏡的成像質(zhì)量，該結(jié)果刊登在2020年10月的Science雜志上。“HexAuFoil”金屬網(wǎng)制備過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)就是采用Moorfield提供的高精度電子束蒸發(fā)技術(shù)以及液氮冷卻的低溫樣品臺，使得Au膜當(dāng)中的粒徑更小，在縮小金屬網(wǎng)圓孔直徑的情況下仍保證了金屬網(wǎng)孔的圓度和質(zhì)量。

圖1：生長在Si 片上的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)陣列

（圖片由分子生物學(xué)MRC實驗室的Neil Grant提供）

說到冷凍電鏡，近幾年在分子生物學(xué)方向可謂是大放異彩，我國生物學(xué)家用冷凍電鏡技術(shù)在結(jié)構(gòu)生物學(xué)方面也做出了許多舉世矚目的重要成果。冷凍電鏡技術(shù)幾乎完·美的實現(xiàn)了對生物大分子的高精度觀察。但在實際應(yīng)用中仍有很多因素限制了冷凍電鏡觀測精度的進(jìn)步提升。其中重要因素之是由于電子束照射導(dǎo)致金屬網(wǎng)上的玻璃態(tài)的水膜發(fā)生移動從而影響觀測精度。英國劍橋大學(xué)的Christopher J. Russo研究組對金屬網(wǎng)上玻璃態(tài)水膜的移動建立了物理模型，通過分析得出水膜的直徑和厚度存在個臨界比值，超過臨界比值，水膜在快速冷凍過程中會由于應(yīng)力作用發(fā)生彎曲，并有部分應(yīng)力凍結(jié)在內(nèi)部。而在電子束照射時，由于電子束照射作用提高了水膜中水分子的擴(kuò)散系數(shù)（~1046倍），玻璃態(tài)的水膜便成為了個“超粘流體”，水膜的應(yīng)力會進(jìn)步的釋放使得水膜的曲率發(fā)生變化，從而導(dǎo)致了生物大分子的位移，而這個位移只發(fā)生在電子束照射時，從而影響成像質(zhì)量。

圖2：A冷凍電鏡在觀測時樣品的位置移動，B、C不同角度，不同孔徑對位移的影響，D水膜曲率變化導(dǎo)致樣品位移的示意圖。E孔徑比的臨界值（孔的直徑/水膜厚度）

如果縮小金屬網(wǎng)孔的直徑，使水膜的直徑和厚度比值在臨界以內(nèi)，在冷凍時水膜內(nèi)聚集的能量不足以使水膜發(fā)生彎曲，電子束照射的能量也不會引發(fā)水膜曲率的變化，僅僅會引起水分子的擴(kuò)散，而擴(kuò)散對成像的影響遠(yuǎn)小于曲率的變化。從而可以提高冷凍電鏡的成像質(zhì)量。因此制備高精度小孔徑金屬網(wǎng)格就顯得尤為重要。Christopher J. Russo課題組用了高精的光刻和電子束蒸發(fā)薄膜制備技術(shù)在硅片上成功的批量制備出了孔徑在200 nm尺度的金屬支撐網(wǎng)，使得冷凍電鏡測量時樣品的位移小于1埃米。

圖3：用“HexAuFoil”金屬網(wǎng)的冷凍電鏡觀測結(jié)果

后作者用制備的“HexAuFoil”金屬網(wǎng)對223-kDa DPS蛋白質(zhì)進(jìn)行了冷凍電鏡的觀測。結(jié)果表明，采用“HexAuFoil” 金屬網(wǎng)可以有效減小樣品的移動，使得分辨率輕松突破2埃米（更多細(xì)節(jié)請參考原文）。該篇文章介紹了種減小樣品位置漂移提高冷凍電鏡精度的有效途徑。

Moorfield薄膜制備與加工設(shè)備

Moorfield Nanotechnology是英國材料科學(xué)域高性能儀器研發(fā)公司，成立26年來注于高質(zhì)量的薄膜生長與加工技術(shù)，擁有雄厚的技術(shù)實力，推出的多種高性能設(shè)備受到科研與工業(yè)域的廣泛好評。Moorfield公司近十年來與曼徹斯大學(xué)諾獎技術(shù)團(tuán)隊緊密合作，推出的臺式高精度薄膜制備與加工系列產(chǎn)品由于其體積小巧、性能·越、易于操作更是受到很多科研單位的贊譽。Moorfield Nanotechnology推出的大型系列設(shè)備具有更大的配置自由度，可以滿足各種用戶的殊功能需求，并且接受設(shè)備的殊定制化設(shè)計。

冷凍電鏡背景介紹

2017年諾貝爾化學(xué)獎頒給了發(fā)明冷凍電鏡（Cryo-EM）的三位科學(xué)家，哥倫比亞大學(xué)教授Joachim Frank、蘇格蘭分子生物學(xué)家和生物物理學(xué)家Richard Henderson、以及瑞士洛桑大學(xué)生物物理學(xué)榮譽教授Jacques Dubochet以表彰他們在冷凍顯微術(shù)域的貢獻(xiàn)。嚴(yán)格來說，其實這次化學(xué)獎是頒發(fā)給了三維“物理學(xué)家”以表彰他們對生物域做出的·越貢獻(xiàn)。Richard Henderson在20世紀(jì)90年代改進(jìn)了電子顯微鏡，實現(xiàn)了原子分辨率；Joachim Frank在70、80年代開發(fā)了種圖像合成算法，能將電子顯微鏡模糊的二維圖像解析合成清晰的三維圖像；Jacques Dubochet發(fā)明了迅速將液體水冷凍成玻璃態(tài)以使生物分子保持自然形態(tài)的技術(shù)。這些發(fā)明使低溫冷凍電子顯微鏡得到很大的化。

為什么觀察蛋白質(zhì)等生物大分子需要冷凍電鏡呢？這是由于蛋白質(zhì)等生物大分子往往只能保存在水溶液中無法滿足電鏡的真空要求，并且這些生物大分子是通過氫鍵鏈接的，電子的轟擊會導(dǎo)致氫鍵斷裂破壞分子結(jié)構(gòu)，此外蛋白質(zhì)等活性物質(zhì)是運動的，不是個靜止?fàn)顟B(tài)。由于以上原因，普通電鏡是不能用于觀察蛋白質(zhì)等生物活性物質(zhì)的?？茖W(xué)家們經(jīng)過探索發(fā)現(xiàn)，快速冷凍可使水在低溫狀態(tài)下呈玻璃態(tài)，減少冰晶的產(chǎn)生（水凝結(jié)成冰晶體積會膨脹從而會破壞生物分子結(jié)構(gòu)），從而不影響樣品本身結(jié)構(gòu)，生物大分子就可以冷凍在這個玻璃態(tài)的水里，通過冷凍傳輸系統(tǒng)保證在樣品始終保持在低溫狀態(tài)下，這樣就可以對樣品進(jìn)行電鏡觀察了。然后用計算軟件通過大量的二維照片解析出生物大分子的三維結(jié)構(gòu)，這便實現(xiàn)了對生物大分子的高精度觀測。

近些年來，冷凍電鏡在結(jié)構(gòu)生物學(xué)域大放異彩，使得對蛋白質(zhì)等生物大分子的研究取得了長足的發(fā)展。我國生物學(xué)家去年在新·冠病毒研究方面取得的諸多進(jìn)展中也有很多重要的工作都用到了冷凍電鏡技術(shù)。

【參考文獻(xiàn)】

[1]. Naydenova K , Jia P , Russo C J . Cryo-EM with sub–1 specimen movement[J]. Science, 370.

【相關(guān)產(chǎn)品】

1、臺式高精度薄膜制備與加工系統(tǒng)

https://www.chem17.com/st166724/product_34731514.html2.臺式高性能多功能PVD薄膜制備系列—nanoPVDhttps://www.chem17.com/st166724/product_34660266.html3.多功能高磁控濺射噴金儀—nanoEMhttps://www.chem17.com/st166724/product_34736871.html4.臺式精準(zhǔn)氣氛\壓力控制高溫退火系統(tǒng)—ANNEALhttps://www.chem17.com/st166724/product_34736567.html5.臺式二維材料等離子軟刻蝕系統(tǒng)—nanoETCHhttps://www.chem17.com/st166724/product_34660308.html6.臺式高性能CVD石墨烯/碳納米管快速制備系列—nanoCVDhttps://www.chem17.com/st166724/product_34660149.html